质粒纯化试剂盒-武汉菲恩生物科技有限公司

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质粒纯化试剂盒

Assay试剂盒

发布时间：2020-10-15 11:44 咨询量：

英文名称：Plasmid Purification Kit

产品货号： K003

简介：菲恩生物质粒纯化试剂盒用于提取高质量的质粒DNA，可用做真核生物转染和体外表达的分子生物学实验，基于SDS碱性裂解方法，并通过使用硅胶膜结合柱为提取和纯化提供了快速操作。

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产品详情

名称：

Plasmid Purification Kit

介绍：

菲恩生物质粒纯化试剂盒旨在提取高质量的质粒DNA，用于真核生物转染和体外表达的分子生物学实验。该试剂盒基于SDS碱性裂解方法，并通过使用硅胶膜结合柱为提取和纯化提供了快速操作。使用该试剂盒，可以在不到1小时的时间内分离出质粒DNA，其纯度为A260 / A280> 1.86，从而大大减少了提取时间并实现了高纯度。

货号：

K003

存储：

1.回收柱CM应干燥保存，并应在室温（15-25℃）下使用。它们可以保存至少2年，而不会降低性能、容量或分离质量。
2.菲恩生物的质粒试剂盒应在室温下保存。加入RNase A后，缓冲液P1应在2-8℃下保存，并稳定6个月。其他缓冲液和RNase A储备溶液可以在室温下保存2年。

套件组分：

规格	50次实验	200次实验
缓冲液P1	15ml（毫升）	60ml（毫升）
缓冲液P2	15ml（毫升）	60ml（毫升）
缓冲液N3	20ml（毫升）	80ml（毫升）
缓冲液PB	25ml（毫升）	100ml（毫升）
缓冲液PE	15ml（毫升）	60ml（毫升）
缓冲液EB	10ml（毫升）	30ml（毫升）
RNase A（10毫克/毫升）	150ul（微升）	600ul （微升）
回收柱CM	50	200

操作步骤：

1.将1.5 ml培养物添加到离心管中，并以12,000 rpm离心1分钟，并弃去上清液。
2.向离心管中加入250ul 缓冲液P1（包括RNase A）并重悬细菌细胞。注意：重悬沉淀后，确保没有细胞团可见。
3.向离心管中加入250ul 缓冲液P2。轻轻倒转试管6至8次进行混合。注意：必须轻柔地进行第3步，否则基因组DNA可能会破裂。如有必要，可将离心管倒转6次以上直至溶液澄清，并确保将反应时间限制在5分钟以内。
4.加入350ul 缓冲液N3。盖上盖子并轻轻颠倒6至8次进行混合。
5.将试管以12,000 rpm的转速离心10分钟，然后会出现白色球形颗粒。
6.将上清液转移到柱收集管中，并以12,000 rpm离心柱收集管1分钟，然后丢弃过滤后的溶液。
7.用PB Buffer清洗色谱柱收集管。向柱收集管中添加500ul PB缓冲液，并以12,000 rpm离心30至60秒，然后弃去过滤的溶液。
8.用PE缓冲液清洗色谱柱收集管。向柱收集管中添加750ul PE缓冲液，并以12,000 rpm离心30至60秒，然后弃去过滤的溶液。
9.重复步骤8，再次清洗色谱柱收集管。
10.消除残留的PE缓冲液。将步骤9的色谱柱收集管在12,000 rpm的转速下离心2分钟，然后将色谱柱打开盖并暴露在空气中5分钟以挥发PE缓冲液。注意：残留的PE缓冲剂可能会抑制后续反应并导致提取失败。
11.将离心柱转移到透明的离心管中。要洗脱DNA，请在柱膜中央添加50-100 µl EB缓冲液（1 0 mM Tris•Cl，pH 8.5）或水（pH 7.0–8.5），将柱静置1分钟，然后离心。柱1分钟。重要：确保将洗脱缓冲液直接分配到柱膜上，以完全洗脱结合的DNA。洗脱效率取决于pH。在pH 7.0和8.5之间达到最大洗脱效率。使用水时，请确保pH值在此范围内，并将DNA储存在-20°C，因为在没有缓冲剂的情况下DNA可能降解。纯化的DNA也可以在TE缓冲液（10 mM Tris•Cl，1 mM EDTA，pH 8.0）中洗脱，但是EDTA可能会抑制随后的酶促反应。

原理：

菲恩生物质粒纯化方案基于改良的碱裂解程序，然后在适当的低盐和pH条件下将质粒DNA与树脂结合。RNA，蛋白质，染料和低分子量杂质可通过中盐洗涤去除。质粒DNA在高盐缓冲液中洗脱，然后浓缩并通过异丙醇沉淀脱盐。

产量的确定：

为了确定产量，应该通过260 nm的紫外分光光度法和琼脂糖凝胶上的定量分析来确定DNA浓度。为了进行可靠的分光光度法DNA定量，A260读数应介于0.1和1.0之间。

琼脂糖凝胶分析：

我们建议在纯化过程中取出并保存等分试样。如果质粒DNA的产量或质量较低，则可以通过琼脂糖凝胶电泳对样品进行分析，以确定出现问题的纯化步骤。

安全事项：

使用化学药品时，请始终穿着实验服，一次性手套和护目镜。

故障排除指南：

问题	原因	意见建议
DNA产量低	细胞裂解不良	在添加缓冲液P2之前，细胞可能尚未充分分散。确保涡旋细胞悬浮液使其完全分散。
	细胞裂解不良	增加与缓冲液P2的孵育时间以获得清晰的裂解物。
	细菌克隆生长过度或不新鲜	在37℃下不要将培养物孵育超过16小时。在质粒分离之前，将培养物长时间保存是有害的。
	洗脱效率低	洗脱缓冲液或水的pH值必须≥8.0。
没有DNA洗脱	TE Buffer不能用无水乙醇稀释	根据制备2准备DNA洗涤缓冲液浓缩液。
产品的高分子量DNA污染	加入缓冲液P2后，细胞裂解液过度混合	添加缓冲液P2后，请勿涡旋或剧烈混合。
琼脂糖凝胶上可见的RNA	RNase A未添加到缓冲区P1	检查是否已使用试剂盒随附的RNaseA。如果缓冲液P1已使用6个月，则添加更多的RNaseA
加载琼脂糖凝胶时质粒DNA浮出孔	在步骤10中，乙醇尚未完全从离心塔中除去	洗脱前，将离心柱在空气中暴露更多分钟以干燥色谱柱。

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