Top1：标曲显色过强无明显梯度

1、主要怀疑点：洗板不充分：

1.1、机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。

1.2、手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。

1.3、特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。

2、次要怀疑点：

2.1、TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。

2.2、检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。

2.3、酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。

2.4、环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。

Top2：显色较弱或不显色，没有说明书提供的数据阳性强

可能原因分析：

1、检查标准品是否受潮或者拿错

2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC， 如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。

3、移液器是否校准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g  100ul=0.1g  10ul=10mg

4、37度培养箱是否校准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。

5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。

6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。

7、试剂盒过期。

Top3：复孔做的不好，CV值差异大

可能原因分析：

1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。

2、操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。

3、加样尽量快速准确，不要产生气泡。

4、样品需要做预实验，使用不同浓度进行测试，找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大

Top4：显色太快，背景小于0.2，但是样品没有阳性。试剂盒工作正常，但是样品没有阳性。

可能原因分析：

1、样品是否保存妥当。蛋白容易降解，最好保存在-80℃，或者新鲜样品立即检测。

2、样品含有的基质影响抗原抗体结合，导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5，1/10，1/100，1/1000来摸索最佳检测稀释比，稀释液稀释样品后会消弱基质效应，阳性就会升高。

3、部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品，如果样品稀释后还是检测不到阳性，建议4度16小时孵育标准品和样品，其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作。

4、如果是特殊的样品，请通过邮件与我们技术支持进行联系。

TOP5：稀释过的样本OD 值比没有稀释的样本值高些

1、血清有基质效应，会导致试剂盒回收率下降。所以用原液检测数值会低于稀释后的数据。

2、FineTest®ELISA试剂盒提供的稀释液有抗基质成分，说明书要求样品至少稀释1倍以上

3、血清的基质的一类异嗜性抗体或者溶血后的物质，这些物质会封闭捕获抗体，导致抗体无法结合样品中的蛋白，当稀释后 这类物质效应下降，回收率就升高。

Top6：标曲方程选择问题

一般我们选择曲线平滑上升或者下降，所有点都在曲线上，R值接近于1的方程