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elisa试剂盒实验中常见的5大问题应该如何解决？
来源：菲恩生物 发布时间：2019-11-14 10:47 点击量：
酶联免疫吸附测定法（elisa）是最基础的免疫学实验之一，ELISA试剂盒操作看似简单，实则不然。ELISA试剂盒操作是一个非常严谨、极考验操作者技巧和经验的实验，检测结果没有读值、高cv值、高背景等诸多问题也是兵家常事。为了更好的解决这些问题，我们列举了Elisa试剂盒实验中常见的一些问题及解决方案。希望对各位从事科研工作的小伙伴有所帮助。
1.显色浅，灵敏度低
| 序 号 | 原因 | 解决方法 |
| 1 | 试剂盒运输时间过长，受高温天气影响酶的活性降低 | 试剂运输过程中放足够的冰袋并尽可能缩短运输时间 |
| 2 | 试剂盒（包括未使用完的板条及其他组分）保藏条件不正确。 | 试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条要密封保存。 |
| 3 | 试剂盒使用时间已超期限 | 过期试剂盒不可使用 |
| 4 | 温育时间不够 | 严格按照说明书操作 |
| 5 | 恒温箱温度达不到37℃ |
注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37 ±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱门。 |
| 6 | 加样量不足;移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多。 |
经常校正移液器，注意吸头要与移液器吻合 。移液不宜过快，排放要完全。 |
| 7 | 显色剂加量不足 | 按照说明书要求加入适量显色液 |
| 8 | 试剂、样品使用前未平衡至室温。 | 试剂、样品从低温保藏条件中拿出来。 |
| 9 | 试剂开启时间过长，污染。 | 试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完。 |
2.出现假阳性，背景高甚至花板
| 序 号 | 原因 | 解决方法 |
| 1 | 加样时污染 | 注意更换枪头，尽可能避免污染。 |
| 2 | 加酶时污染。 | 对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换吸头，切忌侥幸心里。 |
| 3 | 恒温箱温度过高。 | 注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37士0.5℃。 |
| 4 |
整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔 与最后一孔反映应时间相差很悬殊）。气温高时 更明显。 |
在尽可能短的时间内完成操作;尽量不要堆积块板子操作（尤其手工操作时）。 |
| 5 | 洗液稀释倍数过高。 | 按照要求倍数稀释洗液。 |
| 6 | 洗板时浸泡时间不够。 | 按要求操作，并适当延长浸泡时间。 |
| 7 | 洗板次数不够。 | 按要求操作，不可任意减少洗板次数。 |
| 8 | 手工洗板方式不对。 | 洗板时垂直加入洗液，并保证一定的冲击力;洗板要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时间。 |
| 9 | 酶、显色液污染。 | 使用容器要注意容器的清洁，避免污染。 |
| 10 | 显色完后没有终止反应。 | 显色完立即终止反应。 |
3.重复性不好
| 序号 | 原因 | 解决方法 |
| 1 | 加样量多少不一，操作时间长短不一。 |
重复同一样品时，加样量与加样时间相同; 同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标 板放置在微量振荡器上，充分混合;标本保 证一致、无污染;尽可能由同一名操作人员 操作，尽可能模拟相同的反应条件。 |
| 2 | 加入标本后没有混匀。 | |
| 3 | 重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。 | |
| 4 | 反应时间、温度等不同。 | |
| 5 | 标本不同（被混添或者处理不同）。 |
4.白板
| 序号 | 原因 | 解决方法 |
| 1 | 忘记加酶。 | 严格按照说明书操作。 |
| 2 | 忘记加显色液。 | 严格按照说明书操作。 |
| 3 | 酶或显色液污染失效。 | 防止组分被污染，注意保存。 |
| 4 | 把终止液当显色液。 | 可以在加样槽上贴标签避免错加。 |
5.标曲有值 样本无值
| 序 号 | 原因 | 解决方法 |
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样本孔没有读值或读值极低 | ①分析标准曲线的读值、标准曲线R值、背景值高低等，例如，即使标准曲线最高值只有1.2，但R值为0.999，这样的标准曲线同样可用。 |
| ②如果标准曲线正常，则可以排除ELISA试剂盒的品质问题，此时需要考虑样本中目标蛋白的表达含量，从实验经验来看，样本中目标蛋白表达量低是没有读值最常见的原因。 |
为减少在试验中可能碰到的问题，应严格按照试剂盒内说明书操作，使用前应检查盒内试剂是否超过有效期，并确定所有试剂齐全。
菲恩生物使用全机器生产，排除人工的不稳定性，依靠电子移液枪和自动包板机精确加样，严格控制批内差批间差。
