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免疫沉淀（IP）实验7大常见问题及解决方案
来源：菲恩生物 发布时间：2023-08-04 14:56 点击量：
免疫沉淀（IP）是一种可以纯化和富集目标蛋白的沉淀技术，在蛋白质组学研究中可用于识别蛋白质与蛋白质之间的相互作用。免疫沉淀是一种重要的技术，用于研究蛋白质之间的存在、相对丰度、大小、上调或下调、稳定性、翻译后修饰（PTMs）以及相互作用。以下为免疫沉淀实验常见问题及解决方案，希望对大家的实验有帮助。
1.变性洗脱法：如果后续进行WB分析，可用此法十分高效，但洗脱下来的蛋白没有生物活性。
六、阳性和阴性对照如何设置
阳性对照：就是常说的input,可直接用细胞裂解液或提取好的蛋白进行WB,确定样本中目的蛋白的存在。
一、背景高
1.样本中有不溶蛋白残留，离心后应立即取出上清。
2.洗涤不充分，优化洗涤缓冲液，通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂（0.5-1%NP-40/Triton X-100/Tween-20）、增加盐离子浓度（如250mM NaCl/1-2mM DTT/β-ME），增加洗涤时间和次数来提高洗杂效率。
3.有非特异蛋白和磁珠结合，磁珠用BSA预封闭不充分，确保BSA新鲜，将磁珠和1%BSA 孵育1小时，使用前PBS洗涤3-4次。
4.抗体特异性不好，使用亲和纯化，特异性好的抗体。
5.抗体用量太多导致非特异结合，尝试使用更少的抗体。
6.裂解液中蛋白含量太高，导致洗涤液有很多假阳性蛋白，减少样本用量。
7.蛋白和抗体非特异结合，可以在免疫沉淀之前预先将磁珠和样本孵育，清理样本中可以和磁珠结合的成分，一些研究人员也使用同型对照来预清理裂解液。
8.样本中目的蛋白降解，样本裂解时严格低温操作，加入过量蛋白酶抑制剂。
9.高强度洗脱缓冲液（如SDS-PAGE上样缓冲液）将导致多种非特异蛋白和抗原一起洗脱，温和的缓冲液（如0.1M甘氨酸，pH2.5）可防止此类污染。
二、大量抗体被洗脱
抗体用量太高，尝试减少抗体用量。
三、没有检测到目的蛋白洗脱
1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。
2.抗体用量不够，检查抗体用量，提高使用量。
3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。
4.抗体没有结合磁珠，确保使用的磁珠和抗体亚型匹配，磁珠正确保存，防止变质或干燥。
5.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40,RIPA, western及IP细胞裂解液。
四、加样顺序对靶蛋白得率的影响
磁珠、抗体、抗原样本混合一起孵育，速度最快，但靶蛋白纯度和得率会很低。
间接法是抗体和抗原样本先结合，再加入磁珠孵育，靶蛋白得率最高，直接法是磁珠先和抗体结合，再加入抗原孵育，对于表达丰度高的蛋白，两种方法差别不大，如果表达丰度低，要选择间接法获得更高的靶蛋白得率。
五、抗原洗脱方法的选择
2.酸性洗脱法：如果要对洗脱后蛋白进行功能分析，则用酸性洗脱法，0.1M-0.15甘氨酸（pH2.5-3）是最高效的非变性洗脱液。
3.竞争洗脱法：如果靶蛋白带有标签，可用高浓度标签或配体进行竞争性洗脱，洗脱后样本具有生物活性，且没有抗原片段污染。
阴性对照：如用同型对照作为阴性对照，来排除非特异结合的情况。
七、二抗如何选择
| IP捕获抗体 | WB检测一抗 | WB检测二抗 | 备注 |
| 小鼠来源 | 小鼠来源 | HRP-protein A 或HRP-抗小鼠IgG | WB一抗若为mouse lgG1/lgG3亚型，HRP-标记 ProteinA亲和力较低，可适当降低其稀释度（也可先尝试HRP-抗小鼠lgG二抗); WB一抗若为小鼠 lgM/lgA亚型，则避免选择HRP- ProteinA，因其不结合。 |
| 兔来源 | HRP-抗兔IgG | ||
| 兔来源 | 小鼠来源 | HRP-抗小鼠IgG | |
| 兔来源 | HRP-protein A或HRP-抗兔IgG轻链特异性抗体 | HRP-Protein A可以有效降低重链信号以及消减轻链信号的影响，背景干净，适用于检测目的蛋白大小除45-55kDa之外的所有目的蛋白，而目的蛋白大小在45-55kDa之间时，推荐使用HRP-标记抗兔lgG轻链特异性二抗。 |
